Institut für Physiologische Chemie und Pathobiochemie

Arbeitsgruppe Proteinanalytik

Vorbereitung von Proteinen / Peptiden für die Sequenzierung

• Für die pulsed liquid-Sequenzierung werden minimal 10 pmol eines reinen, gelösten Proteins / Peptids benötigt. Es ist aber zu bedenken, daß die Zahl der möglichen Sequenzierungsschritte und die Eindeutigkeit, mit der die abgespaltenen Aminosäuren identifiziert werden können, mit steigender Probenmenge zunehmen. Ferner ist zu berücksichtigen, daß etwa in der Probe enthaltene Fremdpeptide mit sequenziert werden und die Auswertung für das Hauptprodukt stören. Daran ist insbesondere auch zu denken, wenn das Probeprotein aus unterschiedlichen Untereinheiten aufgebaut ist.

• Bei der geringen molaren Menge des Probenmaterials kann die Konzentration störender Verunreinigungen der Probe sehr schnell das tolerable Maß übersteigen. Daran ist bei der Vorbereitung der Probe möglichst frühzeitig zu denken. Die Sequenzierung und Identifizierung wird insbesondere durch die Anwesenheit primärer und sekundärer Amine gestört. Daher sind z.B. in den letzten Reinigungsschritten Puffer, die Tris, Glycin u.ä. enthalten, nach Möglichkeit zu vermeiden; evtl. müssen solche Pufferbestandteile durch Umfällung der Probe vor der Sequenzierung entfernt werden. Das bei der langsamen Hydrolyse von Acetonitril (HPLC-Proben) entstehende freie Ammoniak überlagert das Signal für Asparaginsäure und macht deren Identifizierung in den ersten Zyklen unmöglich. Peptide, die in organischen Lösemitteln löslich sind, eignen sich nicht für die Sequenzierung. Probe und Probengefäße sollten nicht mit der Hautoberfläche in Berührung kommen!

• Cystein kann ohne vorhergehende Derivatisierung des Peptids nicht identifiziert werden. Auch substituierte oder modifizierte Aminosäuren einer Probe sind normalerweise nicht zu bestimmen.

• Die Blockierung der N-terminalen Aminosäure eines Proteins entweder in vivo oder artifiziell (z.B. durch den Cyanatgehalt von Harnstoff) ist kein ganz seltenes Phänomen; sie verhindert eine Edman-Seqenzierung. In solchen Fällen kann die chemische oder enzymatische Spaltung des Proteins in Spaltpeptide und ihre Auftrennung zu Sequenzinformationen führen.

• Die Probe muß zur Analyse möglichst in weniger als 0,1 ml eines geeigneten Lösungsmittels gelöst sein. Das Lösungsmittel sollte ausreichend flüchtig, möglichst salzarm, frei von Aminen und mit der Stabilität der Probe vereinbar sein.

• Falls vom Auftraggeber kein geeignetes Lösungsmittel benannt (und möglichst bereitgestellt) wird, wird die Probe routinemäßig kurz vor der Analyse in 50proz. Ameisensäure gelöst.

  Hinweise zu: Abwicklung und Kosten der Sequenzierung

  Betreuer: G. Mersmann (mersman@uni-muenster.de) 26.1.1995